Коронавирус SARS-CoV-2: гипотезы влияния на кровеносную систему, перспективы использования перфторуглеродной эмульсии

DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1

Editorial

■

Коронавирус SARS-CoV-2: гипотезы влияния на кровеносную систему, перспективы использования перфторуглеродной эмульсии, возможности биофизических методов исследования (редакционная статья)

В. В. Мороз¹, А. М. Черныш¹, Е. К. Козлова¹,²

¹ НИИ общей реаниматологии им. В. А. Неговского ФНКЦ РР, Россия, 107031, г. Москва, ул. Петровка, д. 25, стр. 2

² Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова Минздрава России,

Россия, 119991, г. Москва, ул. Большая Пироговская, д.2, стр. 4

Coronavirus SARS-CoV-2: Hypotheses of Impact on the Circulatory System, Prospects for the Use of Perfluorocarbon Emulsion, and Feasibility of Biophysical Research Methods (Editorial)

Viktor V Moroz¹, Alexander M. Chernysh¹, Elena K. Kozlova¹,²

¹ V A. Negovsky Research Institute of General Reanimatology,

Federal Research and Clinical Center of Intensive Care Medicine and Rehabilitology, 25 Petrovka Str., Bldg. 2, 107031 Moscow, Russia

² I. M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia,

2 Bolshaya Pirogovskaya Str., Bldg. 4, 119991 Moscow, Russia

Для цитирования: В. В. Мороз, А. М. Черныш, Е. К. Козлова. Коронавирус SARS-CoV-2: гипотезы влияния на кро­веносную систему, перспективы использования перфторуглеродной эмульсии, возможности биофизических ме­тодов исследования. Общая реаниматология. 2020; 16 (3): 4-13. DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1 [На русск. и англ.]

For citation: Viktor V Moroz, Alexander M. Chernysh, Elena K Kozlova. Coronavirus SARS-CoV-2: Hypotheses of Impact on the Circulatory System, Prospects for the Use of Perfluorocarbon Emulsion, and Feasibility of Biophysical Research Methods. Ob- shchaya Reanimatologiya = General Reanimatology. 2020; 16 (3): 4-13. DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1 [In Russ. and Engl.]

Резюме

В данной статье освещены опубликованные гипотезы, связанные с возможностью проникнове­ния коронавируса SARS-CoV-2 в кровеносное русло, его взаимодействия с эндотелием сосудов, эрит­роцитами, гемоглобином и его фрагментами. В результате такого взаимодействия возможен выход иона железа в кровеносное русло и, как следствие, возникновение цитокинового шторма. В этом кон­тексте представляется важным поиск цитопротекторов, которые могут блокировать такие процессы. Одним из таких препаратов может явиться перфторуглеродная эмульсия.

Цель работы — показать возможности биофизических методов для исследования молекулярных механизмов действия SARS-CoV-2 на эритроциты и гемоглобин человека и восстанавливающее и ци- топротекторное действие перфторуглеродной эмульсии при окислении иона железа в геме.

Материалы и методы. Использовали спектроскопию высокого разрешения, атомную силовую мик­роскопию, атомно-силовую спектроскопию, электропорацию. Действовали на кровь окисляющими агентами различной природы. Добавляли перфторуглеродную эмульсию в различных концентрациях и исследовали ее действие при различном времени инкубации. Концентрацию производных гемогло­бина, рассчитывали с учетом мультиколлинеарности, проводили статистический анализ результатов.

Результаты. Показали, что при окислении иона железа в геме перфторуглеродная эмульсия вы­зывает эффективное восстанавливающее и цитопротекторное действие: Fe³⁺ восстанавливался до Fe²⁺. Степень восстановления MetHb до HbO₂ и Hb зависела от концентрации окисляющего агента и времени инкубации. Наблюдали изменение содержания MetHb от (80-90)% до (5-12)%. Перфторугле­родная эмульсия в клинических концентрациях способствовала устранению локальных дефектов мембран и восстанавливала нормальную морфологию эритроцитов.

Заключение. В фокусе рассмотренных гипотез использование перфторуглеродной эмульсии может стать эффективным методом для блокирования последствий воздействия коронавируса на элементы кровеносной системы и восстановления функционального газообмена.

Ключевые слова: эритроцит; мембраны; производные гемоглобина; перфторан; цитопротек­торное действие

Адрес для корреспонденции:	Correspondence to:
Александр Михайлович Черныш E-mail: amchernysh@mail.ru	Alexander M. Chernysh E-mail: amchernysh@mail.ru

4

www.reanimatology.com

GENERAL REANIMATOLOGY, 2020, 16; 3

DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1

Редакционные статьи ■

Summary

This paper highlights published hypotheses on the possibility of coronavirus SARS-CoV-2 entry into the bloodstream, its interaction with vascular endothelium, red blood cells, hemoglobin and its fragments. As a result of such interaction, iron ions may be released into the bloodstream and, subsequently, a cytokine storm may occur. In this context, it is important to find a cytoprotective agent capable of blocking such processes. The perfluorocarbon emulsion could be a candidate for this role.

The aim of the paper is to show the feasibility of biophysical methods to study the molecular mechanisms of action of SARS-CoV-2 on human red blood cells and hemoglobin as well as the restorative and cytoprotective effect of the perfluorocarbon emulsion during Fe²⁺ oxidation in heme.

Materials and methods. High resolution spectroscopy, atomic force microscopy, atomic force spectroscopy, electroporation were used. Blood was exposed to oxidizing agents of different nature. Perfluorocarbon emul­sion was added in various concentrations and its effect at various incubation times was studied. Concentration of hemoglobin derivatives was calculated considering multicollinearity, and statistical analysis of the results was performed.

Results. The perfluorocarbon emulsion was shown to have an effective restorative and cytoprotective ac­tion in iron ion oxidation in the heme: Fe³⁺ was restored to Fe²⁺. The degree of MetHb reduction to HbO₂ and Hb depended on the concentration of the oxidizing agent and incubation time. We observed a change in MetHb content from 80-90% to 5-12%. The perfluorocarbon emulsion in clinical concentrations helped eliminate local membrane defects and restored normal erythrocyte morphology.

Conclusion. In the light of the studied hypotheses, the use of perfluorocarbon emulsion can become an effective method for blocking the consequences of coronavirus effect on the blood cells and restoring a normal gas exchange.

Keywords: erythrocyte; membranes; hemoglobin derivatives; perftoran; cytoprotective action

DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1

Введение (гипотезы)

Пандемия COVID-19 поставила перед нау­кой новые задачи, решение которых, по оче­видным причинам (короткий временной интервал, недостаточность исходных сведе­ний), на сегодня не представляется возмож­ным. Данные о происхождении новой модифи­кации коронавируса пока ограничены и продолжают пополняться. Большое количе­ство вопросов возникает по поводу особенно­стей его существования в кровеносном русле человека, молекулярных механизмов взаимо­действия с эндотелием кровеносных сосудов, с клетками крови, с гемоглобином. Знания в этой области — скорее отдельные гипотезы, пока практически лишенные системных научных обоснований.

Коронавирус SARS-CoV-2. Новый корона­вирус SARS-CoV-2 — один из семейства Coron- aviridae, включающее на январь 2020 года более 40 видов РНК-содержащих вирусов, которые поражают человека и животных. В феврале 2020 г. китайские ученые выделили штамм коронавируса и впервые продемон­стрировали изображения SARS-CoV-2 с помо­щью электронного микроскопа. Снимки полу­чены в национальном хранилище патогенных микроорганизмов, были опубликованы на сайте ведомства, представлены ВОЗ и широко иллюстрируются в открытой печати. В литера­туре появились и другие изображения вируса, полученные на электронном микроскопе [1]. Исследователи из Университета Гонконга получили изображение выхода коронавируса

Introduction (Hypotheses)

The COVID-19 pandemic has set new chal­lenges for science which, for obvious reasons (short time interval, lack of initial data), cannot be solved today. Data on the origin of the new coronavirus modification are still limited and continue to be up­dated. Many questions arise about the pattern of its existence in the human bloodstream, molecular mechanisms of interaction with the endothelium of blood vessels, blood cells, hemoglobin. The knowledge in this field is mostly represented by iso­lated hypotheses, which so far have practically no systematic scientific rationale.

Coronavirus SARS-CoV-2. The new coron­avirus SARS-CoV-2 is a member of the Coronaviri- dae family, which as of January 2020 includes more than 40 species of RNA-containing viruses affecting humans and animals. In February 2020, Chinese scientists isolated the coronavirus strain and demonstrated SARS-CoV-2 electronic microscope images for the first time. The images were obtained from the national repository of pathogens and pub­lished on the agency’s website, presented to WHO and are widely used by mass media. Other virus im­ages from the electron microscope have appeared in the literature [1]. Researchers from the University of Hong Kong received an image of coronavirus ex­iting from an infected cell. The obtained images suggest that the size of SARS-CoV-2 practically does not differ from the other coronaviruses and is 100-125 nm [2], and its peplomers (club-shaped «spikes») have a height of about 10 nm. While pass­ing through the cell membrane, the virus «stretches out» and changes its shape.

GENERAL REANIMATOLOGY, 2020, 16; 3

www.reanimatology.com

5

DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1

Editorial

из зараженной клетки. Из полученных изобра­жений следует, что размеры SARS-CoV-2 прак­тически не отличаются от размеров других коронавирусов и составляют 100-125 нм [2], а его пепломеры (булавовидные «шипы») имеют высоту около 10 нм. При прохождении через мембрану клетки вирус «вытягивается» и меняет форму.

SARS-CoV-2, эритроцит, гемоглобин. При­водятся гипотезы о взаимодействии SARS-CoV-2 с эритроцитами, о его влиянии на гемы и порфи­рин. Рассматриваются 2 возможных пути взаи­модействия белков вируса с гемоглобином [3].

Первый — связан с выходом гемоглобина из эритроцита и его попаданием в кровеносное русло. Это может происходить в результате гемолиза эритроцитов, например — иммуно­логического. События, развивающиеся после попадания гема и иона Fe+² в кровеносное русло и дальнейшее развитие оксидативного стресса, описаны ранее [4, 5].

Второй путь предполагает проникновение вируса или его белков через плазматическую мембрану в эритроцит и дальнейшее взаимо­действие белков вируса с гемом и порфири­ном. Отмечается, что дезоксигемоглобин более подвержен вирусным атакам, чем оксигениро­ванный гемоглобин — HbO₂ [3]. Атакующее действие вирусных белков вызывает уменьше­ние содержания HbO₂, реализующего газо­обмен в организме, и как следствие — дыха­тельную недостаточность.

SARS-CoV-2, кровеносная система. Рас­сматриваются и иные механизмы. В частно­сти — связывание SARS-CoV-2 с клетками эндотелия кровеносной сети человека [1]. Такое взаимодействие имеет достаточно высокую вероятность существования и под­тверждается фактом возникновения тромбо­за у заболевших COVID-19 пациентов [6]. Воз­можно взаимодействие вируса не только с сосудистой стенкой, но с мембранами эрит­роцитов в микрососудах. Вирусные белки, проникшие в клетку, взаимодействуют с 1 бета цепью гемоглобина [3], вызывают эффект экранирования части молекул гемо­глобина Hb (screening effect), уменьшая поток кислорода из эритроцита в ткани через капиллярную стенку и, соответственно, из альвеол в капилляр.

В некоторых работах отмечается, что SARS- CoV-2, связываясь с клеточными рецепторами АПФ2 и CD 147, имеет возможности для проник­новения в клетку и на стадиях выхода вириона из клетки разрушать ее мембраны [7, 8]. Нару­шение целостности мембран может стать при­чиной внутрисосудистого гемолиза (intravascu­lar hemolysis), выхода свободного гемоглобина (cell-free Hb) эритроцита в кровеносную систе-

SARS-CoV-2, erythrocyte, and hemoglobin. Various hypotheses on the interaction of SARS- CoV-2 with erythrocytes and its effect on hems and porphyrin have been suggested. Two possible ways of interaction of virus proteins with hemoglobin are considered [3].

The first one is related to hemoglobin exit from erythrocyte and its entry into bloodstream. This may occur as a result of erythrocyte hemolysis, e.g. immunological. The events occurring after hem and Fe+² ion enter the bloodstream and further ox­idative stress development have been previously described [4, 5].

The second way assumes penetration of the virus or its proteins through plasma membrane into erythrocyte and further interaction of viral proteins with hem and porphyrin. Deoxyhemoglobin has been noted to be more susceptible to viral attacks than the oxygenated hemoglobin HbO₂ [3]. The on­slaught of viral proteins causes a decrease in the con­tent of HbO₂, a major contributor to gas exchange in the body, and results into respiratory failure.

SARS-CoV-2 and circulatory system. Other mechanisms are also under consideration. In par­ticular, the binding of SARS-CoV-2 to endothelial cells of human circulation system may be rele­vant [1]. Such interaction is highly likely and was confirmed by thrombosis occurrence in COVID-19 patients [6]. The virus may interact not only with the vascular wall, but also with RBC membranes in microvasculature. The viral proteins penetrating the cell interact with 1-beta hemoglobin chain [3], cause the screening effect of part of hemoglobin molecules, which reduces the oxygen flow from erythrocyte to tissues through the capillary wall and, accordingly, from alveoli to capillaries.

In some works, SARS-CoV-2 binding to ACE2 and CD 147 cell receptors was noted to enable viral penetration into the cell and destruction of cell membranes during virion exit [7, 8]. The destruc­tion of membrane integrity may cause intravascu­lar hemolysis and release of the cell-free Hb into the blood system [9, 10]. Release of Hb into plasma sig­nificantly reduces the bioavailability of nitrogen oxide (NO) in the vessel, promoting vasoconstric­tion, endothelial dysfunction and platelet activa­tion. Vasoconstriction (including that in micro ves­sels) and thrombosis are typical for Covid-19 patients [6].

Filtration-reabsorption equilibrium in the mi­crovasculature and surrounding tissues may be dis­turbed if the cell structure of capillary walls is im­paired [11]. As a result, interstitial edema, alveolar hemorrhage and microvascular lung thrombosis occur [12]. Progressive endothelial thrombo-in- flammatory syndrome may also include microvas­culature of brain and other vital organs, resulting in multi-organ failure observed in patients with Covid-19 [1, 2].

6

www.reanimatology.com

GENERAL REANIMATOLOGY, 2020, 16; 3

DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1

Редакционные статьи

му [9, 10]. Декомплементация Hb в плазму значительно ухудшает биодоступность оксида азота (NO) в сосуде, способствуя вазокон­стрикции, вызывая эндотелиальную дис­функцию и активацию тромбоцитов. У паци­ентов с Covid-19 обнаруживается сужение сосудов, в том числе и микрососудов, образо­вание тромбов [6].

При нарушениях структуры клеток стенок капилляров может нарушиться фильтрацион- но-реабсорбционное равновесие в микрососу­де и окружающих тканях [11]. В результате воз­никает интерстициальный отек, alveolar hemorrhage (кровоизлияние в альвеолу) и мик- рососудистый тромбоз легких [12]. Прогресси­рующий эндотелиальный тромбо-воспали­тельный синдром может также включать микрососудистое русло мозга и других жизнен­но важных органов, приводя к полиорганной недостаточности, что наблюдается у пациентов с Covid-19 [1, 2].

Опасность представляет взаимодействие SARS-CoV-2 с клетками костного мозга. В работе [13] описан случай leukoerythroblastosis при Covid-19, связанный с нарушением кост­ного мозга и выходом модифицированных эритроцитов.

Описанные гипотезы предполагают взаи­модействие короновируса или его белков со стенками кровеносных сосудов, эритроцитами, гемоглобином. В них рассматривается взаимо­действие белков SARS-CoV-2 с гемом и порфи­рином, попадание ионов Fe+² в кровеносное русло и дальнейшее их окисление до Fe+³. Такие патологические процессы могут блокироваться и/или восстанавливаться с помощью антиокси­дантов и цитопротекторов [14]. Использование препаратов этого класса может способствовать разработке методов борьбы с Covid-19.

Цель работы — показать возможности биофизических методов для исследования молекулярных механизмов действия SARS- CoV-2 на эритроциты и гемоглобин человека и восстанавливающее и цитопротекторное дей­ствие перфторуглеродной эмульсии при окис­лении иона железа в геме.

Материал и методы

Схема опытов. Забор крови производили в мик- роветты с ЭДТА (Sarstedt AG and Co., Germany) во время профилактического осмотра доноров. В соот­ветствии с требованиями этического комитета НИИ общей реаниматологии им. В. А. Неговского РАМН получили согласие всех доноров на проведение ис­следований. Схему опытов представили на рис. 1. На кровь (150 мкл) воздействовали окисляющим аген­том, в качестве которого использовали либо раствор NaNO₂, либо ультрафиолетовое излучение (UV). В опытах для промыва клеток и разбавления суспен­зии использовали буфер PBS tablets (MP Biomedicals,

The SARS-CoV-2 interaction with bone mar­row cells is dangerous. A paper [13] describes a case of leukoerythroblastosis in Covid-19 associated with bone marrow damage and release of modified red blood cells.

The described hypotheses suggest that the coronavirus or its proteins interact with the walls of blood vessels, erythrocytes, and hemoglobin. They consider the interaction of SARS-CoV-2 pro­teins with heme and porphyrin, the entry of Fe+² ions into the bloodstream and their further oxida­tion to Fe+³. Such pathological processes can be blocked and/or restored with antioxidants and cy- toprotectors [14]. The use of drugs of this class may help develop methods to control Covid-19.

The aim of the paper is to show the feasibility of biophysical methods to study the molecular mechanisms of impact of SARS-CoV-2 on human red blood cells and hemoglobin and the restorative and cytoprotective effect of perfluorocarbon emul­sion during the iron oxidation in heme.

Materials and Methods

Scheme of experiments. Blood was drawn in EDTA microvettes (Sarstedt AG and Co., Germany) during a rou­tine screening of donors. In accordance with the require­ments of the ethics committee of the V A. Negovsky Scien­tific Research Institute of General Reanimatology the consent of all donors for the study participation was ob­tained. The scheme of experiments is shown in fig. 1. Blood (150 pl) was exposed to an oxidizing agent which was either NaNO₂ solution or ultraviolet radiation (UV). The PBS tablets buffer (MP Biomedicals, USA), (pH 7,4) was used in experiments for cell washing and suspension dilution. Micro-22R centrifuge (Hettich-Zentrifugen GMBH&Co. KG, Germany) was used for cell separation and sedimen­tation. The UNICO 2800 (USA) digital automatic spec­trophotometer was used to record optical spectra. The method of calculation of hemoglobin derivatives concen­trations, the solution of multicollinearity problem, and rel­evant statistical analysis were described elsewhere [15, 16].

Atomic force microscopy and spectroscopy. Im­ages of RBC morphology were obtained using the atomic force microscope (AFM) NTEGRA Prima (NT-MDT, Russ­ian Federation) in a resonance mode on monolayers pre­pared using the sedimentation method. Cantilevers NSG01 (R=10 nm, coefficient of elasticity K = 5 N/m) were used. The number of scanning points was 512, 1024. Scanning fields were 100X100 pm², 30X30 pm². 2D and 3D images were obtained using AFM software [15]. Sta­tistical analysis of the obtained results was performed using the Origin Lab software (USA).

Electroporation (USA). Laboratory electroporator provides pulse duration 3-5 ms, pulse amplitude 3X10³ V A cuvette 30X30 mm was equipped with flat titanium electrodes mounted on opposite walls. The intensity of the generated field was 1040 V/cm [17].

Results and Discussion

The development of oxidation processes in blood caused by NaNO₂ and ultraviolet radiation (X=254 nm) was simulated using in vitro experi-

GENERAL REANIMATOLOGY, 2020, 16; 3

www.reanimatology.com

7

DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1

Editorial

Рис. 1. Стадии экспериментов: воздействие окисляющим агентом на кровь, добавление PFC или цитофлавина в раз­личной концентрации, измерение оптических спектров, расчет концентраций производных гемоглобина, получение АСМ изображения клеток и наноповерхности мембран.

Fig. 1. Stages of the experiments: blood exposure to the oxidizing agent, addition of PFC or cytoflavin in various concentrations, measurement of optical spectra, calculation of concentrations of hemoglobin derivatives, obtaining an AFM image of cells and membrane nano-surface.

Примечание. Oxidizing agent — окисляющий агент; blood — кровь; cell separation, washing and sedimentation — центри­фугирование, промыв клеток, осаждение; RBC — эритроциты; PFC —перфторуглеродная эмульсия; AFM — АСМ.

USA), pH 7,4. Для разделения и осаждения клеток ис­пользовали центрифугу Micro-22R (Hettich-Zentrifu- gen GMBH&Co.KG, Germany). Для регистрации опти­ческих спектров использовали цифровой автоматический спектрофотометр UNICO 2800 (USA). Методика расчета концентраций производных гемо­глобина, решения проблемы мультиколлинеарности, статистического анализа описана ранее [15, 16].

Атомная силовая микроскопия и спектроско­пия. Изображения морфологии эритроцитов полу­чали с помощью атомного силового микроскопа (АСМ) NTEGRA Prima, (NT-MDT, Российская Федера­ция) в резонансном режиме на монослоях приготов­ленных с помощью метода оседания. Использовали кантилеверы NSG01, R = 10 нм, коэффициент упру­гости K = 5 N/m. Число точек сканирования — 512, 1024. Поля сканирования: 100X100 мкм², 30X30 мкм². Получали изображения 2D и 3D форматах, используя программное обеспечение АСМ [15]. Проводили ста­тистическую обработку полученных результатов, ис­пользуя программное обеспечение «Origin Lab» (USA).

Электропорация. Лабораторный электропора- тор реализует длительность импульса (3-5) мс, ампли­туду импульса 3Х10³ В. Кювета 30X30 мм, оснащена плоскими титановыми электродами, закрепленными на противоположных стенках. Напряженность созда­ваемого поля в объеме 1040 В/см [17].

Результаты и обсуждение

В экспериментах in vitro моделировали развитие окислительных процессов в крови,

ments. Fe²⁺ turned into an oxidized form (Fe³⁺) in the molecules of hemoglobin, which was evidenced by the transformation of oxyhemoglobin HbO₂ into methemoglobin MetHbO₂. The concentration and dose dependence of these processes was estab­lished. Fe⁺³ is known to prevent gas exchange be­tween blood and tissues. Therefore, the appearance of MetHb in the blood leads to tissue hypoxia, and in high concentrations can even be fatal.

Perfluorocarbon compound «Perftoran» (Russian Federation) [18, 19] and cytoflavin (Poly­san, Russian Federation) [15] were used to reduce Fe⁺³ to Fe⁺² and, accordingly, to transform MetHb to HbO₂. At the same time, methemoglobin was re­duced to oxyhemoglobin depending on the con­centrations of these substances and incubation time. Concentrations of perftoran (PFC) were recorded later as indices (pl PFC per 200 pl of ery­throcyte suspension). Cytoflavin concentrations were recorded as volume of cytoflavin (pl) per 150 pl of cell suspension. Fig. 2 shows MetHb concentra­tions on UV exposure and after introduction of Perftoran emulsion, the optical spectra, as well as the AFM field erythrocyte images under the same conditions.

Initially, 90-98% of erythrocytes were disco- cytes (fig. 2, a). After UV exposure, the number of discocytes decreased, and stomatocytes, echinocytes, sphero-echinocytes, ghost cells ap-

8

www.reanimatology.com

GENERAL REANIMATOLOGY, 2020, 16; 3

DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1

Редакционные статьи

Рис. 2. Восстанавливающее действие PFC в суспензии эритроцитов.

Fig. 2. The reducing effect of PFC in erythrocyte suspensions.

Note. а — AFM 3D cell images: initial (control cells) on the left, the cells damaged by the UV exposure are in the middle, on the right are the cells damaged by UV and subsequently exposed to PFC for 24 hours; b — percentage of MetHb, HbO₂, Hb in the control, after UV exposure and subsequent PFC exposure, PFC incubation time was 24 hours; c — absorption spectrum changes after UV exposure and subsequent PFC action (t=0, 12, 24 hours).

Примечание. а — АСМ 3D-изображения клеток: слева — исходные (контрольные) клетки, в середине — клетки, повреж­денные в результате действия UV излучения, справа — клетки после UV воздействия и последующего действия PFC в течение 24 час; b — процентное содержание MetHb , HbO₂: Hb в контроле, после воздействия UV и последующего дей­ствия PFC, время инкубации PFC 24 часа; c—динамика изменений спектра поглощения после воздействия UV излучения и последующего действия PFC50 (t=0, 12,24 часа).

вызванное NaNO₂ и ультрафиолетовым излуче­нием (Х=254 нм). В молекулах гемоглобина Fe²⁺ переходил в окисленную форму — Fe³⁺, о чем свидетельствовало превращение оксигемогло­бина HbO₂ в метгемоглобин MetHbO₂. Устано­вили концентрационную и дозовую зависимо­сти этих процессов. Известно, что Fe³⁺ не позволяет осуществлять газообмен между кровью и тканями. Поэтому появление MetHb в крови ведет к гипоксии тканей, а при высо­кой концентрации может приводить даже к летальному исходу.

Для восстановления Fe³⁺ в Fe²⁺ и, соответ­ственно, для превращения MetHb в HbO₂ использовали перфлюорокарбоновое соедине­ние «Перфторан» (РФ) [18,19] и цитофлавин (Полисан, РФ) [15]. При этом метгемоглобин вос­станавливался до оксигемоглобина в зависимо­сти от концентраций этих веществ и времени инкубации. Концентрации перфторана (PFC) записывали далее в виде индексов (мкл PFC в 200 мкл суспензии эритроцитов). Концентрации

peared (fig. 2, b). As a result of subsequent PFC ex­posure, the percentage of discocytes recovered to 80-90%. The change in erythrocyte shapes associ­ated with changes in concentrations of hemoglobin derivatives (fig. 2, b, c). The initial content of MetHb was about 0.5%. After UV exposure it increased to 35-40%, and after PFC exposure it was 2-5%. Thus, in vitro experiments showed that perftoran can be effectively used to restore MetHb to HbO₂.

These experimental data demonstrate the restorative effect of PFC on erythrocytes both in damage to membranes and cell structure, and in abnormal hemoglobin molecules.

The effect of agents on the system can be demonstrated by time and concentration depend­ence. Absorption spectra of hemoglobin derivatives solutions for different incubation times with PFC are shown in fig. 2, c. With increasing incubation time, peak at wavelength 630 nm dropped, and peaks at 542 nm and 577 nm grew, which indicates a decrease in MetHb content and, consequently, an increase in HbO₂+Hb.

GENERAL REANIMATOLOGY, 2020, 16; 3

www.reanimatology.com

9

DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1

Editorial

цитофлавина записывали как объем цитофла- вина (мкл) в 150 мкл суспензии клеток. На рис. 2 представили концентрации MetHb при действии UV и после введения эмульсии «Перфторан», оптические спектры, а также изображения эритроцитов в поле АСМ в тех же условиях.

Исходно 90-98% эритроцитов были диско- цитами (рис. 2, а). После воздействия UV коли­чество дискоцитов уменьшалось, при этом появлялись стоматоциты, эхиноциты, сфероэ- хиноциты, тени (рис. 2, b). В результате после­дующего действия PFC процентное содержа­ние дискоцитов восстанавливалось до 80-90%. Изменение форм эритроцитов сопровожда­лось изменением концентраций производных гемоглобина (рис. 2, b, c). Исходное количество MetHb было около 0,5%. После воздействия UV оно возросло до 35-40%, а после действия PFC составило 2-5%. Таким образом, в эксперимен­тах in vitro показали, что можно эффективно использовать перфторан для восстановления MetHb в HbO₂.

The concentration dependence of the PFC ex­posure is shown in fig. 2, a (left). As early as at the concentration of PFC 5-10 pl/ml of the suspension there was a significant reduction of Fe³⁺ to Fe²⁺, i. e., MetHb to HbO₂ + Hb.

The qualitative result of transformation of methemoglobin into oxyhemoglobin is presented in the photo (fig. 2, a, right). The dark brown sus­pension after UV exposure changed its color to red after 24 hours of incubation with PFC.

Cytoflavin was also used as a reducing agent (fig. 3, b). In these cases the dependence of effect on concentration was also observed. Cytoflavin al­lowed reducing MetHb concentration from 80-90% to 20-25%.

Exposure of RBCs to oxidizing agents can pro­duce two effects:1) oxidation of iron, Fe²⁺ to Fe³⁺, and, accordingly, increase of MetHb concentration in them; 2) erythrocyte hemolysis.

Depending on the nature of the agent, the ratio of these biophysical processes was different (fig. 3, c, d). Thus, if the oxidizing agent was ionizing

Рис. 3. Производные гемоглобина.

Fig. 3. Hemoglobin derivatives.

Note. a — Suspension after UV irradiation and subsequent PFC exposure in various concentrations (concentration dependence) on the left, photos of suspension after UV irradiation and subsequent incubation with PFC for 24 hours on the right; b — MetHb formation as a result of NaNO₂ exposure and reduction of Fe³⁺ to Fe²⁺ after exposure to cytoflavin in different concentrations (con­centration dependence); c and d — correlation of biological effects (iron oxidation and hemolysis) after exposure to different agents: c — UV irradiation; d — addition of NaNO₂.

Примечание. а — слева — суспензия после UV облучения и последующего действия PFC в различных концентрациях (концентрационная зависимость); справа — фотографии суспензии после UV облучения и последующей инкубации с PFC в течение 24 час; b — образование MetHb в результате действия NaNO₂ и восстановление Fe³⁺ до Fe²⁺ под действием цитофлавина различной концентрации (концентрационная зависимость); c и d— соотношение биологических эффектов (окисление железа и гемолиз) при действии различных агентов: с — UV облучение; d — добавление NaNO₂.

10

www.reanimatology.com

GENERAL REANIMATOLOGY, 2020, 16; 3

DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1

Редакционные статьи

Рис. 4. Дефекты мембран эритроцитов в поле атомного силового микроскопа при действии фармакохимических аген­тов различной природы и протекторный эффект перфторуглеродной эмульсии «Перфторан».

Fig. 4. Defects of erythrocyte membranes in the field of atomic force microscope after exposure to various chemical agents and the protective effect of the Perftoran perfluorocarbon emulsion.

Эти экспериментальные данные свиде­тельствуют о восстанавливающем действии PFC на эритроциты как при повреждениях мембран и структуры клеток, так и при нару­шении состояния молекул гемоглобина.

Показателем действия агентов на систему является временная и концентрационная зависимости. На рис. 2 с привели спектры поглощения растворов производных гемогло­бина для различного времени инкубации с PFC. С увеличением времени инкубации пик на длине волны 630 нм уменьшался, а на 542 нм и 577 нм пики увеличивались, что свидетель­ствовало об уменьшении содержания MetHb и, соответственно, об увеличении HbO₂+Hb.

Концентрационную зависимость дей­ствия PFC представили на рис. 2, а (слева). Уже при концентрации PFC 5-10 мкл/мл суспензии происходило значительное восстановление Fe⁺³ до Fe⁺², то есть MetHb до HbO₂+Hb.

Качественно результат превращения метге­моглобина в оксигемоглобин представили на фотографии (рис. 2, а, справа). Темнокоричневая суспензия после UV воздействия меняла цвет на красную после 24 часов инкубации с PFC.

radiation, UV radiation, both processes occurred with the same intensity, and the dose dependence and irradiation time dependence was observed (fig. 3, c). When using the NaNO₂ agent (depending on the concentration), the content of MetHb in ery­throcytes was intensively increased, but their he­molysis was practically absent (fig. 3, d). This inter­esting fact is important to consider when analyzing the effect of factors of different nature, including viruses and bacteria, on red blood cells.

In a number of experiments, the protective ef­fect of the Perftoran emulsion on erythrocyte mem­branes was shown using AFM method (fig. 4). Hemin, ZnSO₄ and furosemide were used as membrane damaging agents. As a result of blood exposure to these agents, topological nanodefects of cell mem­branes in the range of 20-200 nm were found. Sub­sequent exposure to PFC led to a reduction in the size of membrane defects or to their complete «healing».

If the virus causes structural disorders and local cell defects, Perftoran is very likely to have a protective effect and prevent damage to both cells and cell membranes.

A major problem with the Covid-19 pandemic is the high mortality rate of the elderly, with less

GENERAL REANIMATOLOGY, 2020, 16; 3

www.reanimatology.com

11

DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1

Editorial

В качестве восстанавливающего агента использовали также цитофлавин (рис. 3, b). В этих случаях также наблюдали концентра­ционную зависимость действия. Цитофлавин позволил уменьшить концентрацию MetHb c 80-90% до 20-25%.

При воздействии окисляющих агентов на эритроциты могут возникнуть два эффек­та: 1) окисление железа, Fe²⁺ до Fe³⁺, и, соот­ветственно, увеличение содержания в них MetHb; 2) гемолиз эритроцитов.

В зависимости от природы агента, соот­ношение этих биофизических процессов было разным (рис. 3, с, d). Так, если окисляю­щим агентом являлось ионизирующее излучение, UV излучение, то одновременно интенсивно протекали оба эти процесса, при­чем наблюдали дозовую зависимость — зави­симость от времени облучения (рис. 3, с). При использовании агента NaNO₂, (в зависимости от концентрации) интенсивно увеличивалось содержание MetHb в эритроцитах, но практи­чески не наблюдали их гемолиз (рис. 3, d). Этот интересный факт важно учитывать при анализе действия факторов различной при­роды, в том числе и вирусов, и бактерий на красные клетки крови.

В ряде экспериментов методом АСМ пока­зали протекторное действие эмульсии «Перф- торан» на мембраны эритроцитов (рис. 4). В качестве повреждающих мембрану агентов использовали ZnSO₄, гемин, фуросемид. В результате действия этих агентов на кровь наблюдали появление топологических наноде­фектов мембран клеток в диапазоне 20-200 нм. Последующее воздействие PFC приводило к уменьшению, размеров мембранных дефектов, либо к их полному «залечиванию».

Если вирус вызывает нарушения структу­ры и локальные дефекты клеток, то перфто- ран с большой вероятностью может оказать протекторное действие и предотвратить повреждение как самих клеток, так и клеточ­ных мембран.

Тяжелой проблемой при пандемии Covid-19 является высокая смертность заболевших пожилых людей, при том, что инфицирование зависит от возраста людей в меньшей степени. Возможно, что высокая смертность людей пожилого возраста связана с исходным состоя­нием сосудов и мембран эритроцитов.

Используя метод мягкой электропорации (обратимый пробой мембран) мы показали ранее, что мембраны пожилых людей (65-74 лет) действительно более уязвимы, имеют большее количество потенциальных дефек­тов по сравнению с таковыми у людей моло­дого и среднего возраста [17]. Этот метод может способствовать выявлению пациентов

age-dependent infection susceptibility. The high mortality in older persons is probably due to the initial condition of blood vessels and red blood cell membranes.

Using a soft electroporation method (re­versible membrane perforation), we have previ­ously shown that membranes of older persons (65-74 years old) are indeed more vulnerable and have more potential defects than those of young and middle-aged people [17]. This method can help identify patients with increased risk of SARS-CoV- 2 adverse effect on blood cells.

Conclusion

Perfluorocarbon emulsion Perftoran has a cytoprotective effect, provides additional capacity for the transfer of O₂ by blood, and contributes to the reduction of Fe³⁺ to Fe²⁺ in the heme. This emulsion is promising compound that promotes gas exchange in patients in critical conditions and can be used to protect blood cells. In the light of the hypotheses presented, perfluorocarbon emul­sion (Perftoran) can be effectively used to control Covid-19. Atomic force microscopy, high-resolu­tion optical spectroscopy and electroporation methods can be successfully used to study the molecular mechanisms of SARS-CoV-2 action on blood cells. Studies using such methods can pro­vide a scientific rationale for the hypotheses cur­rently presented.

с повышенным риском действия SARS-CoV-2 на клетки крови.

Заключение

Перфторуглеродная эмульсия «Перфто- ран» обладает цитопротекторной функцией, предоставляет дополнительную емкость для переноса О₂ кровью, способствуют восстанов­лению Fe³⁺ до Fe²⁺ в гемах гемоглобина, поэто­му она является перспективным соединени­ем, способствующим газообмену у больных в критических состояниях, и может быть при­менима для защиты клеток крови.

В свете представленных гипотез, перф­торуглеродная эмульсия («Перфторан»), может эффективно использоваться для борьбы с Covid-19. Методы АСМ, оптической спектроскопии высокого разрешения и элек­тропорации могут быть успешно использова­ны для изучения молекулярных механизмов действия коронавируса SARS-CoV-2 на клетки крови. Исследования с использованием подобных методов могут способствовать научному обоснованию гипотез, выдвигае­мых сегодня.

12

www.reanimatology.com

GENERAL REANIMATOLOGY, 2020, 16; 3

DOI: 10.15360/1813-9779-2020-3-0-1

Редакционные статьи

Литература

1. Varga Z., Flammer A.J., Steiger P, Haberecker M., Andermatt R., Zin- kernagel A.S., Mehra M.R., Schuepbach R.A., Ruschitzka F, Moch H. Endothelial cell infection and endotheliitis in COVID-19. Lancet. 2020; 395 (10234): 1417-1418. DOI: 10.1016/S0140-6736 (20)30937­

5. PMID: 32325026.

2. Cyranoski D. Profile of a killer: the complex biology powering the co­ronavirus pandemic. Nature. 2020; 581 (7806): 22-26. DOI: 10.1038/d41586-020-01315-7.

3. Liu W., Li H. COVID-19: Attacks the 1-Beta Chain of Hemoglobin and Captures the Porphyrin to Inhibit Human Heme Metabolism. Chem- Rxiv. 2020; preprint. DOI: 10.26434/chemrxiv.11938173.v8.

4. Janz D.R., Ware, L.B. The role of red blood cells and cell-free hemog­lobin in the pathogenesis of ARDS. J Intensive Care 2015; 3 (20). DOI: 10.1186/s40560-015-0086-3

5. Schaer D.J., Buehler P.W. Cell-free hemoglobin and its scavenger pro­teins: new disease models leading the way to targeted therapies. Cold Spring Harb Perspect Med. 2013; 3 (6): a013433. PMID: 23645855 PMCID: PMC3662353 DOI: 10.1101/cshperspect.a013433.

6. Kloka F.A., Kruipb M.J.H.A., Meerc N.J.M., Arbousd M.S., Gommerse D.A.M.PJ., Kantf K.M., Kapteina F.H.J., Paassend J., Stalsa M.A.M., Huismana M.V., Endemane H. Incidence of Thrombotic Complica­tions in Critically Ill ICU Patients With COVID-19. Thromb. Res. 2020; S0049-3848 (20)30120-1. DOI: 10.1016/j.thromres.2020.04.013. PMID: 32291094.

7. Ulrich H., Pillat M.M.. CD147 as a Target for COVID-19 Treatment: Suggested Effects of Azithromycin and Stem Cell Engagement. Stem Cell Reviews and Reports, 2020 DOI: 10.1007/s12015-020-09976-7

8. Cohen F.S. How Viruses Invade Cells. Biophys J. 2016; 110 (5): 1028-1032. DOI: 10.1016/j.bpj.2016.02.006

9. Orlov Y.I. Intravascular Hemolysis of Red Blood Cells in the Develop­ment of Organ Dysfunctions in Critical Conditions. General Reanima- tology. 2008; 4 (2): 88. [In Russ.] DOI: 10.15360/1813-9779-2008-2-88.

10. Conran N., Almeida C.B. Hemolytic vascular inflammation: an up­date. Rev. Bras. Hematol. Hemoter. 2016; 38 (1): 55-57. DOI: 10.1016/j.bjhh.2015.10.004. PMID: 26969775.

11. Kozlova E.K., Chernysh A.M., Matteys T.N. Modeling of blood flow as the result of filtration-reabsorption processes in capillaries. Adv. Phy­siol. Educ. 2000; 23 (1): 32-39. DOI: 10.1152/advances.2000.23.1.S32. PMID: 10902525.

12. Park M.S. Diffuse alveolar hemorrhage. Tuberc. Respir. Dis. (Seoul). 2013; 74 (4): 151-162. DOI: 10.4046/trd.2013.74.4.151. PMID: 23678356.

13. Mitra A., Dwyre D.M., Schivo M., Thompson G.R., Cohen S.H., Ku N. GraffJ.P Leukoerythroblastic reaction in a patient with COVID-19 in­fection. American Journal of Hematology. 2020, Mar 25. DOI: 10.1002/ajh.25793. [Epub ahead of print]

14. Cheng R. Hospital treatment of serious and critical COVID-19 infec­tion with high-dose Vitamin C. Cheng Integrative Health Center Blog http: //www.drwlc.com/blog/2020/03/18/hospital-treatment-of-se- rious-and-critical-covid-19-infection-with-high-dose-vitamin- c/?fbclid=IwAR3qzrI-tjYloYMlqGQRWUfoionQPWNYjFrRyv- GQ18Rg3GSG9Sn-Z7Ln58

15. Kozlova E., Chernysh A., Sergunova V, Gudkova O., Manchenko E., Kozlov A. Atomic force microscopy study of red blood cell membrane nanostructure during oxidation-reduction processes. J. Mol. Recog­nit. 2018; 31 (10): e2724. DOI: 10.1002/jmr.2724. PMID: 29740886.

16. Jensen FB. Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish. J. Exp. Biol. 2007; 210 (19): 3387-3394. DOI: 10.1242/jeb.008748. PMID: 17872992

17. Moroz V.V., Kozlova E.K., Bogushevich M.S., Chernysh A.M., Bliznyuk U.A., KozlovA.P, Alekseyeva PY. Red Blood Cell Membranes in Donors of Different Age Groups. General Reanimatology. 2006; 2 (3): 9-11. [In Russ.] DOI: 10.15360/1813-9779-2006-3-9-11.

18. Maevsky E., Ivanitsky G., Bogdanova L., Axenova O., Karmen N., Zhi- burt E., Senina R., Pushkin S., Maslennikov I., Orlov A., Marinicheva

I. Clinical results of perftoran application: present and future. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 2005; 33 (1): 37-46. DOI: 10.1081/bio-200046654. PMID: 15768564

19. Rafikova O, Sokolova E., RafikovR., NudlerE. Control of plasma nitric oxide bioactivity by perfluorocarbons: physiological mechanisms and clinical implications. Circulation. 2004; 110 (23): 3573-3580. PMID: 15557364 DOI: 10.1161/01.CIR.0000148782.37563.F8

Поступила 30.04.2020

References

1. Varga Z., Flammer A.J., Steiger P., Haberecker M., Andermatt R., Zin- kernagel A.S., Mehra M.R., Schuepbach R.A., Ruschitzka F., Moch H. Endothelial cell infection and endotheliitis in COVID-19. Lancet. 2020; 395 (10234): 1417-1418. DOI: 10.1016/S0140-6736 (20)30937­5. PMID: 32325026.

2. Cyranoski D. Profile of a killer: the complex biology powering the co­ronavirus pandemic. Nature. 2020; 581 (7806): 22-26. DOI: 10.1038/d41586-020-01315-7.

3. Liu W., Li H. COVID-19: Attacks the 1-Beta Chain of Hemoglobin and Captures the Porphyrin to Inhibit Human Heme Metabolism. Chem- Rxiv. 2020; preprint. DOI: 10.26434/chemrxiv.11938173.v8.

4. Janz, D.R., Ware, L.B. The role of red blood cells and cell-free hemog­lobin in the pathogenesis of ARDS. J Intensive Care 2015; 3 (20). DOI: 10.1186/s40560-015-0086-3

5. Schaer D.J., Buehler P.W. Cell-free hemoglobin and its scavenger pro­teins: new disease models leading the way to targeted therapies. Cold Spring Harb Perspect Med. 2013; 3 (6): a013433. PMID: 23645855 PMCID: PMC3662353 DOI: 10.1101/cshperspect.a013433.

6. Kloka F.A., Kruipb M.J.H.A., Meerc N.J.M., Arbousd M.S., Gommerse D.A.M.P.J., Kantf K.M., Kapteina F.H.J., Paassend J., Stalsa M.A.M., Huismana M.V., Endemane H. Incidence of Thrombotic Complica­tions in Critically Ill ICU Patients With COVID-19. Thromb. Res. 2020; S0049-3848 (20)30120-1. DOI: 10.1016/j.thromres.2020.04.013. PMID: 32291094.

7. Ulrich H., Pillat M.M.. CD147 as a Target for COVID-19 Treatment: Suggested Effects of Azithromycin and Stem Cell Engagement. Stem Cell Reviews and Reports, 2020 DOI: 10.1007/s12015-020-09976-7

8. Cohen F.S. How Viruses Invade Cells. Biophys J. 2016; 110 (5): 1028-1032. DOI: 10.1016/j.bpj.2016.02.006

9. Orlov Y.I. Intravascular Hemolysis of Red Blood Cells in the Develop­ment of Organ Dysfunctions in Critical Conditions. General Reanima- tology. 2008; 4 (2): 88. [In Russ.] DOI: 10.15360/1813-9779-2008-2-88.

10. Conran N., Almeida C.B. Hemolytic vascular inflammation: an up­date. Rev. Bras. Hematol. Hemoter. 2016; 38 (1): 55-57. DOI: 10.1016/j.bjhh.2015.10.004. PMID: 26969775.

11. Kozlova E.K., Chernysh A.M., Matteys T.N. Modeling of blood flow as the result of filtration-reabsorption processes in capillaries. Adv. Phy­siol. Educ. 2000; 23 (1): 32-39. DOI: 10.1152/advances.2000.23.1.S32. PMID: 10902525.

12. Park M.S. Diffuse alveolar hemorrhage. Tuberc. Respir. Dis. (Seoul). 2013; 74 (4): 151-162. DOI: 10.4046/trd.2013.74.4.151. PMID: 23678356.

13. Mitra A., Dwyre D.M., Schivo M., Thompson G.R., Cohen S.H., Ku N. Graff J.P Leukoerythroblastic reaction in a patient with COVID-19 in­fection. American Journal of Hematology. 2020, Mar 25. DOI: 10.1002/ajh.25793. [Epub ahead of print]

14. Cheng R. Hospital treatment of serious and critical COVID-19 infec­tion with high-dose Vitamin C. Cheng Integrative Health Center Blog http: //www.drwlc.com/blog/2020/03/18/hospital-treatment-of-se- rious-and-critical-covid-19-infection-with-high-dose-vitamin- c/?fbclid=IwAR3qzrI-tjYloYMlqGQRWUfoionQPWNYjFrRyv- GQ18Rg3GSG9Sn-Z7Ln58

15. Kozlova E., Chernysh A., Sergunova V., Gudkova O., Manchenko E., Kozlov A. Atomic force microscopy study of red blood cell membrane nanostructure during oxidation-reduction processes. J. Mol. Recog­nit. 2018; 31 (10): e2724. DOI: 10.1002/jmr.2724. PMID: 29740886.

16. Jensen F.B. Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish. J. Exp. Biol. 2007; 210 (19): 3387-3394. DOI: 10.1242/jeb.008748. PMID: 17872992

17. Moroz V.V., Kozlova E.K., Bogushevich M.S., Chernysh A.M., Bliznyuk U.A., KozlovA.P, Alekseyeva PY. Red Blood Cell Membranes in Donors of Different Age Groups. General Reanimatology. 2006; 2 (3): 9-11. [In Russ.] DOI: 10.15360/1813-9779-2006-3-9-11.

18. Maevsky E., Ivanitsky G., Bogdanova L., Axenova O.,., Karmen N., Zhi- burt E., Senina R., Pushkin S., Maslennikov I., Orlov A., Marinicheva I. Clinical results of perftoran application: present and future. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 2005; 33 (1): 37-46. DOI: 10.1081/bio-200046654. PMID: 15768564

19. Rafikova O., Sokolova E., Rafikov R., Nudler E. Control of plasma nitric oxide bioactivity by perfluorocarbons: physiological mechanisms and clinical implications. Circulation. 2004; 110 (23): 3573-3580. PMID: 15557364 DOI: 10.1161/01.CIR.0000148782.37563.F8

Received 30.04.2020

GENERAL REANIMATOLOGY, 2020, 16; 3

www.reanimatology.com

13